丝素蛋白/姜黄素复合膜敷料促进皮肤创面愈合的(2)
按照课题组前期报道的方法制备丝素蛋白/姜黄素复合膜[10]。取2 mL质量分数为4%的丝素蛋白溶液,依次加入500 μL的姜黄素乙醇溶液(5 g/L)、8 μL体积分数50%戊二醛溶液、2 μL体积分数50%甘油的溶液。其中,戊二醛作为交联剂,甘油作为保湿剂。使用涡旋振荡器将上述溶液混合均匀。随后吸取上述混合溶液2 mL置于直径为60 mm的一次性培养皿中,在25 ℃、65%湿度条件下使其缓慢干燥成膜,用镊子小心将膜从培养皿上揭下,即制得丝素蛋白/姜黄素复合膜。在不加入姜黄素乙醇溶液的情况下同上述步骤制备丝素蛋白膜。
1.4.2 力学性能测试 分别将丝素蛋白膜和丝素蛋白/姜黄素复合膜裁剪成3 cm×1 cm长条形试样,用测厚仪测量丝素蛋白/姜黄素复合膜的厚度(对每个样品3个不同区域的厚度进行了测量,其平均值作为力学性能分析的参数)。室温条件下将试样夹持在万能力学试验机薄膜拉伸夹具上,使试样纵轴与上、下夹具的中心连线相重合,测试丝素蛋白/姜黄素复合膜拉伸性能,拉伸速度设置为2 mm/min。每组测量3个样品,根据公式(1)计算丝素蛋白/姜黄素复合膜的断裂强度[18],根据公式(2)计算其杨氏弹性模量[19]:
其中FS为断裂强度(N/mm2),A为样品的宽度(10 mm),B为样品的厚度(mm),F为最大负荷(N)。
其中E为杨氏弹性模量(MPa),σ为应力(MPa),ε为应变(%)。
1.4.3 透光性测试 实验采用紫外可见分光光度计全波长扫描功能测试丝素蛋白膜及丝素蛋白/姜黄素复合膜的透光性,波长范围为300-1 100 nm,采样间隔为2 nm。
1.4.4 光敏抑菌测试 姜黄素是一种强光敏性的物质。研究表明,姜黄素在可见光下杀菌能力显著增强[17]。具有高透光率的丝素蛋白膜是负载姜黄素的优良基质材料,作为伤口敷料时能够最大限度的发挥所负载姜黄素的抗菌性能。根据BORTHAGARAY等[20]、MARSLIN 等[21]和 MARIANELLI等[22]的研究,以金黄色葡萄球菌(革兰阳性细菌,上海鲁微科技有限公司,ATCC )和大肠杆菌(革兰阴性细菌,上海鲁微科技有限公司,ATCC )作为供试菌种,通过平板计数法评价丝素蛋白/姜黄素复合膜在405 nm UV LED光照后抑菌活性的改变。
首先将丝素蛋白/姜黄素复合膜剪成1 cm×1 cm大小置于12孔板中,用体积分数75%乙醇清洗灭菌10 min,再用无菌PBS洗涤丝素蛋白/姜黄素复合膜5 min,重复洗涤3次后吸去PBS。实验分为3组进行:光照组、避光组和空白组,其中光照组将丝素蛋白/姜黄素复合膜置于30 W 405 nm UV LED光源下3 cm处光照10 min,随后加入浓度为107-108CFU/mL的菌液1 mL,37 ℃下避光培养2 h;避光组将丝素蛋白/姜黄素复合膜置于黑暗环境10 min后,加入浓度为107-108CFU/mL的菌液1 mL,37 ℃下避光培养2 h;空白组将丝素蛋白膜置于黑暗环境10 min后,加入浓度为107-108CFU/mL的菌液1 mL,37 ℃下避光培养2 h。随后分别从3组中各吸取200 μL菌悬液接种在琼脂平板上,采用涂布法使菌悬液均匀涂布在琼脂平板上,37 ℃下培养12 h,计算琼脂平板上的菌落数。
1.4.5 动物模型建立
小鼠皮肤全层缺损模型的建立:使用麻醉剂(4%水合三氯乙醛:0.4 g水合三氯乙醛溶解于10 mL生理盐水中,即配即用,按照10 mL/kg的比例[23-24])通过腹腔注射的方式麻醉雌性昆明小鼠。小鼠背部皮肤剃毛后使用脱毛膏将背部细毛脱去,随后使用皮肤打孔器在小鼠背部打出一个直径为6 mm的圆形伤口。将丝素蛋白/姜黄素复合膜剪成直径为1.2 cm的圆片并在254 nm的紫外光下照射30 min灭菌。将20只造模小鼠随机分为实验组和对照组,实验组采用紫外灭菌后的丝素蛋白/姜黄素复合膜覆盖小鼠背部皮肤缺损区域,对照组使用无菌纱布覆盖小鼠背部皮肤缺损创面。随后准备大小适宜的无菌弹性绷带,用持针器、缝合针、缝合线将无菌弹性绷带缝合在缺损皮肤创面周围,避免小鼠啃咬皮肤缺损区域(图 1)。
创面愈合评价:伤后第3,7,14天分别处死实验组、对照组小鼠各3只,拍照记录每只小鼠背部创面愈合情况,采用NIH ImageJ (Java 1.8.0)软件进行计算机图形处理,计算创伤愈合率。采用公式(3)计算创面愈合率[25]:
石蜡包埋切片:伤后第3,7,14天,将创面愈合皮肤组织及附近全层皮肤组织切下,采用无菌生理盐水清洗,然后将其浸泡在体积分数4%中性甲醛溶液(pH=7.2-7.4)中4 ℃保存24 h,再将上述组织取出置于体积分数75%乙醇中4 ℃保存。①取出经甲醛溶液固定后的小鼠创面组织进行梯度脱水:将小鼠创面组织依次置于体积分数80%,90%,95%,100%,100%乙醇中各10 min进行梯度脱水;②透化、浸蜡及塑模:将脱水后的小鼠创面组织置于体积比为1∶1的无水乙醇/二甲苯混合溶液中10 min,然后在二甲苯溶液中透化6 min,更换二甲苯溶液后再浸泡6 min,随后将组织置于65 ℃体积比为1∶1的石蜡/二甲苯混合溶液中浸没1 h,再将组织置于65 ℃的石蜡溶液中浸没1.5 h使组织浸蜡完全,最后将小鼠创面组织正面朝下置于模具槽中,倒入石蜡,静置使石蜡凝固;③切片:修整蜡块,使石蜡中的小鼠创面组织横切面朝上,将蜡块固定在石蜡包埋盒上,使用徕卡轮转式切片机进行连续切片,切片厚度为5 μm;④展片、烤片:将上述连续切片摊在46 ℃中的温水中使其充分展开,再用载玻片将切片迅速捞出,随后置于烤片机上于51 ℃烤片1 h。
文章来源:《材料研究学报》 网址: http://www.clyjxbzz.cn/qikandaodu/2021/0213/588.html
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