聚羟基丁酸酯羟基丁酸酯聚乙二醇氧化石墨烯组(2)
1.4.3 支架亲水性能检测 采用光学仪器测定支架表面与水滴之间的静态接触角,每组3 个样品。用CCD 相机测量每个样品上4 个不同的水滴点。
1.4.4 支架力学性能检测 将材料裁剪成10 mm×15 mm×0.14 mm 大小、有效拉伸长度10 mm 的试件,每组5 个样本,经万能力学试验机进行拉伸测试(100 N 传感器,拉伸速度1 mm/min),得到支架的力-位移关系图、应变率、抗拉强度、杨氏模量。
1.4.5 骨髓间充质干细胞的分离培养 脱颈处死SD 大鼠,无菌条件下取股骨及胫骨,骨头分离后将一侧骨垢剪断,用5 mL 注射器吸取一定量的无菌PBS,将骨髓冲洗至无菌培养品中,反复吹打形成细胞悬浊液,将细胞悬液以1 500 r/min 离心5 min,去上清,用DMEM 完全培养基重悬细胞,获得鼠源性骨髓间充质干细胞,置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养扩增至第3 代,通过流式细胞学检测其有效性。
1.4.6 支架的细胞相容性实验
细胞黏附实验:将3 组支架材料剪成96 孔板小孔大小,每组15 个复孔,铺于板底,加入100 μL 培养基孵育过夜,弃上清。取细胞浓度为1×108L-1的第3 代骨髓间充质干细胞悬液,以100 μL/孔接种,于1,3,6 h 通过MTT 法检测细胞黏附情况[23]。
细胞增殖实验:将3 组支架材料裁剪为5 cm×5 cm 大小,置于6 孔板中,每孔接种2×105个骨髓间充质干细胞。复合培养1,4,7 d 后,根据Alamar Blue 测定试剂盒说明书,将测定溶液与细胞培养基以体积比1 ∶10 混合后加入到每个测试孔中,37 ℃孵育5 h。温育后,取每个样品的测定溶液100 μL 放入96 孔板中,使用多功能酶标仪在544 nm/590 nm的激发/发射下测量荧光强度。
Live/Dead 染色:将3 组支架裁剪为5 cm×5 cm 大小,置于6 孔板中,每孔接种2×105个骨髓间充质干细胞。复合培养7 d 后将样本制备为2 cm×2 cm 大小,用PBS 冲洗2次,每次5 min;加入配置好的Live/Dead 染色试剂室温下作用1 h;PBS 冲洗2 次,每次5 min;共聚焦显微镜下观察,红色荧光为死细胞,绿色荧光为活细胞,并以Image pro 6.0(Rockville,MD,USA)计算其存活率。
1.5 主要观察指标 3 组支架的亲水性、力学性能、微观结构及生物相容性。
1.6 统计学分析 数据采用SPSS 22.0 软件进行处理,结果采用±s表示,组间比较采用单因素方差分析,组间统计学处理,P< 0.05 表示差异有显著性意义,P< 0.01 表示差异有非常显著性意义。
2 结果 Results
2.1 静电纺丝支架的构建 P34HB、P34HB/PEG、P34HB/PEG/GO 静电纺丝前驱液的电导率分别为(0.),(5.),(2.) μs/cm,3 组间比较差异有显著性意义(P< 0.01),见图1。
当黏度仪转子速度为3 r/min 时,P34HB 组的黏度明显小于P34HB/PEG 组、P34HB/PEG/GO 组(P< 0.01);当转子速度为12 r/min 时,P34HB/PEG/GO 组黏度明显大于P34HB 组、P34HB/PEG 组(P< 0.01,P< 0.05);当转子速度为20 r/min 时,P34HB组的黏度低于P34HB/PEG/GO组(P< 0.05),见表1,图1。P34HB 组、P34HB/PEG 组、P34HB/PEG/GO 组喷射流半径夹角分别约为40°,77°,52°,见图1。
表1 |不同转子速度下各组静电纺丝前驱液的黏度 (±s,mPa·s)Table 1 Viscosity of electrospinning solution at different rotor speeds表注:P34HB 为聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯,PEG 为聚乙二醇,GO 为氧化石墨烯。与P34HB 比较,aP< 0.05,bP< 0.01组别 3 r/min 12 r/min 20 r/min P34HB 78. 22. 17. P34HB/PEG 141. 30. 20. P34HB/PEG/GO 147. 37. 25.
2.2 静电纺丝支架形态学表征 体式显微镜显示,P34HB、
P34HB/PEG 支架表面光滑,P34HB/PEG/GO 支架表面粗糙,并可见散在均匀分布的黑点,扫描电镜可见各组支架纤维呈随机分布,P34HB、P34HB/PEG、P34HB/PEG/GO 支架的平均纤维直径分别为0.95,0.88,0.64 μm,见图2。
2.3 静电纺丝支架的亲水性 P34HB 支架的水接触角(107.)°明显高于P34HB/PEG(60.)°和P34HB/PEG/GO 支架(70.)°(P< 0.01),见图3。
2.4 静电纺丝支架的力学性能 结合各组应力-位移曲线,P34HB 组的应变程度大于P34HB/PEG 组、P34HB/PEG/GO 组(P< 0.05,P< 0.01),P34HB/PEG 组的弹性模量小于P34HB/PEG/GO 组(P< 0.05),3 组支架在抗拉强度比较差异无显著性意义(P> 0.05),见图4。
2.5 静电纺丝支架的细胞相容性 流式分析显示,所提取的细胞不表达CD34,高表达CD105,见图5,可鉴定为干细胞。
2.5.1 细胞黏附实验结果 MTT 法测试显示,P34HB/PEG/GO组培养1,3,6 h 的细胞黏附数量多于P34HB 组、P34HB/PEG 组(P< 0.01),见图6。
2.5.2 细胞增殖实验结果 将静电纺丝支架与骨髓间充质干细胞共培养1,4, 7 d 后检测各组荧光强度,直接反映细胞量,可见细胞在3 组支架上均有持续增殖,其中P34HB/PEG/GO组第1 天的细胞量高于P34HB 组(P< 0.05),第4,7 天的细胞量明显高于P34HB 组、P34HB/PEG 组(P< 0.01,P< 0.05),未见明显细胞毒性,见图7。
文章来源:《材料研究学报》 网址: http://www.clyjxbzz.cn/qikandaodu/2021/0224/609.html