羟基磷灰石磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞(2)
1.4.3 细胞与支架复合培养 将HA-TCP 支架分为4 组:A 组加入体积比为1 ∶1 的DMEM 培养液与细胞外基质培养液;B 组加入体积比为1 ∶1 的BMSCs 悬液与HUVECs 悬液,两种细胞数量均为3×104;C 组加入体积比为1 ∶1 的DMEM培养液与HUVECs 悬液,细胞数量为3×104;D 组加入体积比为1 ∶1 的BMSCs 悬液与细胞外基质培养液,细胞数量为3×104。将培养板平稳放入培养箱静置,间隔30 min 取出,按上述细胞悬液及培养液比例循环滴加6 次,培养至21 d 备用[14-15]。
1.4.4 扫描电镜观察细胞在支架表面形态 取共培养21 d 的支架,PBS 轻柔冲洗,4 ℃下在电镜固定液固定过夜,PBS 浸洗10 min×2 次;1%锇酸4 ℃固定1 h,PBS 浸洗10 min×2 次;无水乙醇梯度脱水、干燥、真空喷镀,使用扫描电镜观察细胞在支架表面的状态。
1.4.5 体内颅骨缺损修复实验 将60 只雌性SD 大鼠随机分为4 组,标记为A、B、C、D 组,每组15 只。向大鼠体内以10 mL/kg 剂量腹腔注射3%戊巴比妥钠,严格无菌条件下于大鼠颅骨正中骨缝钻取直径为1 cm 的颅骨片,将A、B、C、D 组支架分别植入大鼠颅骨缺损处,术后4,8,12 周后每组各处死大鼠5 只,取颅骨支架复合物进行影像学观察及组织学检测。
1.4.6 Micro-CT 扫描和大体观察 使用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠,麻醉后进行Micro-CT 扫描。扫描完成后取大鼠颅骨标本,完全剥离支架周围的筋膜组织,在距支架材料3 mm 处剥离骨膜至颅骨骨面,使用涡轮钻磨断颅骨骨质,完整取出颅骨支架复合物,对标本进行大体观察。
1.4.7 苏木精-伊红染色 每组取出完整颅骨支架复合物,进行多聚甲醛固定、EDTA 脱钙、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色,倒置显微镜下观察及拍照。
1.4.8 CD31/34 免疫组织化学染色 每组取出SD 大鼠颅骨支架复合物,进行多聚甲醛固定、EDTA 脱钙、石蜡包埋、切片、脱蜡。体积分数3%H2O2室温孵育11 min,PBS 冲洗4 次。正常山羊血清封闭,37 ℃孵育10 min,滴加一抗4 ℃过夜,PBS 洗片5 min×3 次。滴加二抗37 ℃孵育30 min,PBS 洗片5 min×3 次。DAB 显色,自来水流动冲洗、复染、封固。倒置显微镜下观察拍照并行微血管密度评价[先在低倍视野内(×40、×100 )找到切片内微血管密度较高区域,后在高倍视野内(×200)内总计微小血管的数目,选择5 个微小血管较多视野,计算微血管密度]。切片上CD34 阳性表达区域呈黄色,其颜色深浅可半定量反映CD34 含量,采用Image-pro-plus 6.0软件分析其阳性反应区域累积吸光度。
1.4.9 Elisa 法检测CD31、CD34 含量 取SD 大鼠颅骨支架复合物进行组织匀浆、生理盐水混合样本研磨,3 000 r/min 离心10 min,取上清液,根据说明书使用大鼠(CD31/CD34)Elisa 检测试剂盒进行测定,酶标仪(波长450 nm,15 min)测定A值。
1.4.10 Western Blot 检测血管内皮生长因子A 蛋白表达 取出SD 大鼠颅骨支架复合物进行组织匀浆,超声裂解(强度60%,超声5 s,间歇10 s,5 min),4 ℃下12 000 r/min 离心10 min,取上清液行BCA 法蛋白定量。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶将每组样品分离出的蛋白质转至PVDF 膜上,并在Western 封闭液中震荡封闭1 h。用血管内皮生长因子A蛋白一抗(TBST 1∶1 000稀释)和β-actin抗体(1∶2 000稀释)室温下孵育2 h,TBST 室温摇床上漂洗10 min×3 次。然后与HRP 标记的二抗(1 ∶3 000 稀释)室温下孵育1 h,TBST 室温摇床上漂洗10 min×3 次。用辣根过氧化物酶HRP-ECL 发光法进行显影,置入Bio-rad系统成像拍照并分析蛋白灰度比值,经计算统计后用GraphpadPrism 5.0 绘制柱形图。
1.5 主要观察指标 各组支架植入大鼠骨缺损后的骨形成与血管生成。
1.6 统计学分析 实验数据均以±s表达,使用SPSS 19.0 进行统计学分析,微血管密度采用单因素方差分析,CD34 累积吸光度值及血管内皮生长因子A 蛋白含量组间对比采用LSD-t检验,当P< 0.05 时认为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 BMSCs 的形态 BMSCs 接种于培养皿传至第3 代时,镜下可见细胞呈极性漩涡状生长,形态呈单一均匀的长梭形、扁平形贴壁细胞特征,见图1。
2.2 HA-TCP 支架的微观结构及生物相容性 扫描电镜照片显示,支架表面粗糙,有大小不一的羟基磷灰石和磷酸三钙颗粒不规则排列,颗粒间存在孔隙,为细胞的植入创造良好的微环境(图2A),可见两种细胞能够分别爬行于HA-TCP 支架表面,且细胞形态良好(图2B-D)。其中图2B 可见两种细胞能够共同生长于HA-TCP 支架表面。
2.3 体内骨缺损实验大体观察结果 从图3 可见,随着时间推移支架材料逐渐吸收降解并与周围组织粘连融合,4 组支架上骨质爬行面积由高到低为:B 组>C 组=D 组>A 组;当剥离支架表面纤维结缔组织后可见支架材料表面有血性渗液,4 组血性渗液量由多到少为:B 组>C 组>D 组>A 组;随时间推移4组渗血量均增加,尤其术后12 周时B、C、D 组支架中央可见出血点,且B 组后缘支架与颅骨空隙可见血管网。
文章来源:《材料研究学报》 网址: http://www.clyjxbzz.cn/qikandaodu/2021/0224/608.html